Projekt

Projekt Überblick

Die Problemstellung

Schimmelpilze sind allgegenwärtig vorhandene Mikroorgansimen und gelangen während Produktion und Lagerung in die Verwertungskette von Lebensmitteln und letztendlich zu uns Menschen. Es besteht die Gefahr von Schimmelpilzbefall ganzer Jahresernten, was fatale Folgen für die Wirtschaft und den Versorgungszustand ganzer Nationen bedeuten kann. Um die Sicherheit der Lebensmittel zu gewährleisten ist es unerlässlich frühzeitig Kontaminationen zu erkennen und befallene Lebensmittel rechtzeitig aus dem Verkehr zu ziehen. Hierfür können Mykotoxine, da permanent gebildet, als Biomarker für Pilzkontaminationen in Naturprodukten genutzt werden.

Das Ziel des Teams der TU Darmstadt für den iGEM Wettbewerb 2013 ist es mit molekularbiologischen Methoden und Ingenieurskunst eine günstige und robuste Nachweismethode dieser Mykotoxine zu entwickeln.

Unsere Lösung

Für den einfachen Nachweis von biologischen Giftstoffen entwickeln wir ein handliches Gerät, das jeder sicher und zuverlässig bedienen kann. Hierzu nutzt unser Team verschiedener Methoden aus den Bereichen der synthetischen Biologie, Elektrotechnik und Informationsverarbeitung.

Mit Hilfe der synthetischen Biologie manipulieren wir den Sinnesapparat von Escherichia coli, sodass E.coli nach Bindung von verschiedenen Mykotoxinen und unter Bestrahlung von definiertem Licht eine Fluoreszenz ausgibt. Zur einfachen Detektion verpacken wir die Bakterien in einer Kapsel, die nach Probenzugabe in einen selbst konstruierten Handheld eingeführt wird. Dieser ist mit einem Smartphone verbunden, wodurch das Fluoreszenzsignal über eine App ausgelesen und die Probe überprüft werden kann.

Den Grundstein hierzu legt ein biologisch konstruiertes Detektorsystem basierend auf zwei molekularbiologischen Mechanismen: der Chemotaxis und dem sog. FRET (Fluorescence resonance energy transfer).

Chemotaxis bezeichnet die Beeinflussung der Fortbewegungsrichtung von Mikroorganismen durch Stoffkonzentrationsgradienten. Dies geschieht durch das Binden des zu detektierenden Stoffes an einen Rezeptor im Periplasma des Mikroorganismus, in unserem Fall an den Tar-Rezeptor. Dieser dient zur zielgerichteten Bewegung auf große Konzentrationen der Aminosäure Aspartat zu und ist als Rezeptorkomplex in der Cytoplasmamembran des Organismus integriert. Er besteht aus zwei Teilen von denen jeweils eine Region außerhalb sowie eine innerhalb der Zelle liegt. Wird ein Signalmolekül außerhalb der Zelle gebunden erfolgt eine Konformationsänderung der inneren Region des Rezeptorkomplexes. Die Reizweiterleitung wird durch mehrere Enzyme im Cytoplasma vermittelt, die durch die Konformationsänderung aktiviert werden, dadurch wirkt das Signal auf die Steuerung und Regulation der Bewegung.

Der Fluorescence resonance energy transfer (kurz FRET) wird genutzt um räumliche Abstände markierter Objekte innerhalb eines lebenden Organismus in Echtzeit zu verfolgen. Im Rahmen des FRET wird die Energie eines durch Licht angeregten Farbstoffs, auch Donor genannt, auf einen zweiten Farbstoff, den Akzeptor übertragen. Dessen Emission wiederum ist im Lichtspektrum verschoben. Das bedeutet bringen wir einen blau leuchtenden Donor in räumliche Nähe (ab 10 nm) eines orange leuchtenden Akzeptors wird die Probe oranges Licht abstrahlen. Entfernen sich beide wieder voneinander lässt sich ein ein blaues Lichtsignal als negativ Kontrolle nachweisen, wohingegen das orange Licht abklingt.

Unser Ziel ist es nun die oben beschriebenen Effekte (Chemotaxis und FRET) zu kombinieren um durch Mykotoxine ein bindungsgesteuertes Lichtsignal zu erhalten, das wir messen und auslesen können.

Die Strategie

Um den Rezeptor zur Detektion von Giftstoffen zu nutzen, muss die ursprüngliche Bindetasche des Rezeptors angepasst werden. Hierfür bedienen wir uns eines simplen und bereits etablierten Verfahrens zur Veränderung der Stoffspezifität des Tar-Rezeptors.

Zu diesem Zweck wird der bindende Teil des Rezeptors außerhalb der Zelle geringfügig (fünf Aminosäuren) mutiert und wieder in die Mikroorganismen eingebracht.

Zellen bei denen der Giftstoff an die jeweilige Rezeptormutante bindet, werden auf die Giftstoffe zu schwimmen und dadurch von den inaktiven Rezeptormutanten getrennt und isoliert. Dieses Verfahren wird wiederholt um die schnellsten schwimmenden Mutanten untereinander zu vergleichen um die Rezeptorvariante mit der stärksten Antwort zu gewinnen[1].

Neben der veränderten Stoffspezifität des Rezeptors muss ebenso die Signalvermittlung verändert werden. Bei der bereits benannten bindungsgesteuerten Signalweiterleitung zum innenliegenden Teil des Rezeptorkomplexes handelt es sich um eine Art „Auseinanderklappen“ welches sich dazu eignet durch FRET untersucht zu werden[2].

Um ein durch Mykotoxine induziertes Lichtsignal zu erzeugen koppeln wir ein FRET Donor-Akzeptor Paar an den zellinneren Teil des zuvor optimierten TAR-Rezeptors, mit dem Ziel so stoffspezifische Signale detektieren zu können.

Zur Messung des Mykotoxin induzierten Lichtsignals wird unser Team einen Low-Budget und Open-Source konstruierten handlichen FRET Analysator verwenden, dessen Preis sich im Bereich um die 100 – 200 $ Dollar befindet[3]. In diesen Handheld wird eine Kapsel mit den entsprechenden zur Detektion befähigten Mikroorganismen und der Probe eingeführt. Die Messung kann durch eine möglichst einfache Bedienung, z.B. einem „1-Knopf-Mechanismus“ getätigt werden um letztlich an ein angeschlossenes Smartphone zur Auslesung gesendet zu werden.

Um die Messdaten sauber und verwertbar darzustellen ist die Konstruktion einer Android Smartphone App der Abschluss unseres Projektes. Die App soll in der Lage sein, die in den Handheld eingeführte Kapsel zu identifizieren und ein Online-Testprotokoll anzulegen um Messergebnisse zu teilen und zu kontrollieren. Somit lässt sich überprüfen ob ein Lebensmittel durch Schimmelpilze verunreinigt ist oder nicht.

Literaturverzeichnis

[1] Derr, P. B. (2006). Changing the Specificity of a Bacterial Chemoreceptor. Journal of Molecular Biology , 923–932.

[2] Kentner, D., & Sourjik, V. (2009). Dynamic map of protein interactions in the Escherichia coli chemotaxis pathway. Molecular systems biology , 238.

[3] Yan, H. (2005). An inexpensive LED-based fluorometer used to study a hairpin-based DNA nanomachine. DNA Computing , 399-409.