Degradierung

Degradieung

Die Gruppe Degradierung des TU Darmstadt iGEM Teams 2012 besteht aus 6 Studenten und 2 Doktoranden. Unserer Ziel ist es Fusionsproteine auf der Zelloberfläche von E.Coli und S.cerevisiae zu bringen um dort das Polymer Polyethylenterephthalat (PET) zu degradieren und in seine Monomere Terephthalsäure (TPA) und Ehtylenglyco zul zerlegen.

Die Fusionsproteine bestehen aus einer Signalsequenz (PhoA) zur Sekretion ins Periplasma, einem His-Tag zur Detektion via FACS, verschiedenen katalytischen Domänen zur Hydrolyse des PET's und einem C-terminalen Membrananker.

Die Signal Sequenz (PhoA Signal Peptid), die katalytische Domänen und der Membrananker werden aus verschiedenen Spender Vektoren entnommen, da das Standard BioBrick System des iGEM-Wettbewerbs nach jeder Insertion Stoppcodons vermittelt und somit die Synthese von Fusionsproteinen nicht erlaubt. Danach werden störende Schnittstellen (PstI, EcorI, SpeI oder XbaI) in der codierenden Sequenz entfernt. Wir bedienen uns daher beim Zusammenfügen der einzelnen Funktionselementen der herkömmlichen Klonierungsverfahren.

Nachdem die Fusionsproteine erstellt und in das BioBrick System überführt wurden und anschließend in E.coli Produktionsstämmen inseriert um hohe Mengen an Protein für die Charakterisierung zu erzeugen.

Die Aktivität der auf der Zelloberfläche präsentierten Fusionsproteine wird auf Tributyrin-Agarplatten untersucht. Danach in einen Chassis Stamm eingeführt, der alle Funktionen aus den Arbeitsgurppen Degradierung, Transport und Metabolismus beinhaltet.

Die Aktivität unserer Fusionsproteine wird erst qualitativ über die Ausplattierug auf Tributyrin-Agarplatten untersucht. Parallel dazu wird durch einen fluoreszenzmarkierten Antikörper eine quantitative Aussage über die Zelloberflächenexpression via FACS gemacht.

Die Charackterisiertung der Enzymaktivität (Quantitative Parameter: Vmax, Km etc.) werden photometrisch über ein pNP-Assay mit dem Standardsubstrat (4-nitrophenyl Butyrat) und 2 weiteren von der Metarailwissenschafs Gruppe synthetisierten Substraten gemacht. Die Hydrolyse auf PET-Monomeren wird mittels Säure-Base Titration und HPLC gemessen. Im Anschluss dieser Untersuchungen wird die PET-spezifische Hydrolyseaktivität auf nativen PET-Mikropartikel mit verschiedenen Körnungen analysiert.